因業(yè)務(wù)調(diào)整，部分個(gè)人測試暫不接受委托，望見諒。

檢測項(xiàng)目

樣本預(yù)處理：組織勻漿與離心處理，參數(shù)包括離心力3000g，時(shí)間15min

核酸提取：磁珠法提取DNA/RNA，提取純度要求OD260/280在1.8-2.0范圍內(nèi)

PCR引物設(shè)計(jì)：靶向蛙病毒MCP基因保守區(qū)，擴(kuò)增片段長度200-500bp

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：檢測靈敏度達(dá)10拷貝/μL，循環(huán)閾值(Ct值)≤38為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)

巢式PCR擴(kuò)增：二次擴(kuò)增提高特異性，退火溫度梯度設(shè)置55-65℃

電泳分析：瓊脂糖凝膠濃度1.5%，電壓120V，時(shí)間30min

測序驗(yàn)證：Sanger法雙向測序，序列相似度≥98%確認(rèn)病毒型別

陽性對(duì)照設(shè)置：含靶序列的重組質(zhì)粒，濃度梯度100-10⁶拷貝/μL

陰性對(duì)照設(shè)置：無核酸酶水及健康蛙組織樣本

內(nèi)參基因檢測：β-actin基因擴(kuò)增驗(yàn)證樣本質(zhì)量，Ct值≤32為有效

熔解曲線分析：熔解溫度(Tm值)偏差±0.5℃判定特異性

限性稀釋試驗(yàn)：確定病毒載量，檢測下限1TCID₅₀/mL

檢測范圍

養(yǎng)殖場蝌蚪：體長20-50mm蝌蚪的肝臟及尾部組織

成體蛙表皮拭子：皮膚黏液采樣面積≥4cm2

蛙卵樣本：單批次檢測≥100枚卵的勻漿液

水體沉積物：池塘底泥樣本采集深度0-15cm

生物餌料：水蚤、搖蚊幼蟲等載體生物整體制備懸液

病理組織：肝、腎、脾臟器官的10%組織勻漿

運(yùn)輸工具表面：車廂內(nèi)壁擦拭采樣面積100cm2

養(yǎng)殖器械：網(wǎng)具、捕撈工具表面生物膜采集

野生蛙種群：林蛙、樹蛙等野外個(gè)體的口腔拭子

兩棲動(dòng)物飼料：冷凍紅蟲、豐年蝦的微生物負(fù)載檢測

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：模式蛙種（非洲爪蟾）的腎臟細(xì)胞培養(yǎng)物

疫苗產(chǎn)品：蛙病毒滅活疫苗的殘留核酸驗(yàn)證

檢測標(biāo)準(zhǔn)

OIEAquaticAnimalHealthCodeChapter2.1.2

ISO20307:2017動(dòng)物健康監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室規(guī)范

GB/T34796-2017水產(chǎn)動(dòng)物病毒核酸檢測通則

NY/T3997-2021蛙類病毒病診斷技術(shù)規(guī)程

SN/T5643.1-2023出境兩棲動(dòng)物檢疫方法

GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

JJF1717-2018核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)校準(zhǔn)規(guī)范

ISO/IEC17025:2017檢測實(shí)驗(yàn)室能力通用要求

檢測儀器

生物安全柜：提供ISO5級(jí)防護(hù)環(huán)境，氣流速度0.45±0.05m/s

冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速15000rpm，溫度控制范圍-20℃至40℃

核酸定量儀：紫外分光光度法檢測波長260/280nm，檢測限0.2ng/μL

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：支持四通道熒光檢測，溫控精度±0.1℃

電泳系統(tǒng)：電壓范圍5-300V，配套凝膠成像分析模塊

超低溫冰箱：-80℃樣本儲(chǔ)存，溫度波動(dòng)±3℃

自動(dòng)核酸提取儀：并行處理32樣本，磁珠回收率≥95%

梯度PCR儀：升降溫速率≥5℃/秒，溫控均勻性±0.25℃

檢測流程

1、咨詢：提品資料(說明書、規(guī)格書等)

2、確認(rèn)檢測用途及項(xiàng)目要求

3、填寫檢測申請(qǐng)表(含公司信息及產(chǎn)品必要信息)

4、按要求寄送樣品(部分可上門取樣/檢測)

5、收到樣品，安排費(fèi)用后進(jìn)行樣品檢測

6、檢測出相關(guān)數(shù)據(jù)，編寫報(bào)告草件，確認(rèn)信息是否無誤

7、確認(rèn)完畢后出具報(bào)告正式件

8、寄送報(bào)告原件